要使ELISA試劑盒測定得到的作用，不論是定性的仍是定量的，有必要嚴峻依照規矩的方法制備試劑和施行測定。
首要試劑的制備要害已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗刷液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應中止液等，制作時不可漫不經心。
緩沖液可于冰箱中短期保存，運用前應查詢是否蛻變。蒸餾水的質量在ELISA中也至關重要，運用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。
測定的施行中，應力求各個過程操作的標準化，下面以板式ELISA為例，介紹有關留心事項。
（一）ELISA實驗加樣
在ELISA中除了包被外，一般需進行45加樣。在定性測定中有時不強調加樣量的性，例如規矩為加樣一滴。此刻應該運用相同口徑的滴管，堅持的加樣姿勢，使每滴液體的體積底子相同。在定量測定中則加樣量應力求。
標本和結合物的稀釋液應按規矩制作。加樣時應將液體加在孔底，防止加在孔壁上部，并留心不可出現氣泡。
（二）ELISA實驗保溫
在ELISA中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此刻反應的溫度和時刻應按規矩的要求，保溫容器是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不該疊在一同。為防止蒸發，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。
濕盒應該是金屬的，傳熱簡略。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其間，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。參與底物后，反應的時刻和溫度一般不做嚴峻要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實驗臺上，以便不時查詢，待對看管顯色適當時，即可中止酶反應。
（三）ELISA實驗洗刷
洗刷在ELISA過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的要害。洗刷的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的煩擾物質。聚苯乙烯待塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的。
因此在ELISA測定的反應過程中應盡量防止非特異性吸附，而在洗刷時又應把這種非特異性吸附的煩擾物質洗刷下來。在標本和結合物的稀釋液和洗刷液中參與聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質即右到達此目的。
聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質，常作為助溶劑。依據脂肪酸的品種而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中zui為常用。它的洗刷作用好，并具有削減非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗刷如不*，特別在zui后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。其他，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而發作煩擾。
ELISA板的洗刷一般可采用以下方法：①吸干孔內反應液；②將洗刷液注滿板孔；③放置2min，略作搖擺；④吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗刷的次數一般為3～4次，有時甚至需洗5～6次。
（四）ELISA實驗比色
如陰性對照色彩極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定作用，性決定于ELISA板底的平坦與透明度和比色計的質量。
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